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溶菌酶的性质及制备方法有哪些?
点击次数:345 发布时间:2021-08-24

溶菌酶的性质及制备方法有哪些?

溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase),是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNARNA、脱辅基蛋白形成复合体,使病毒失活。 该酶广泛存在于人体多种组织中,鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、乳汁等液体,以及微生物也含此酶,其中以蛋清含量最为丰富。 其中根据其来源的不同,可以将其分为四类,分别是植物溶菌酶、动物溶菌酶、微生物溶菌酶以及蛋清溶菌酶。

性质:
1
、溶菌酶纯品呈白色、微黄或黄色的结晶体或无定形粉末,无异味,微甜,易溶于水,不溶于丙酮。溶菌酶遇碱易被破坏,但在酸性环境下,溶菌酶对热的稳定性很强,在pH值为4-7时,100处理1min,仍能较好地保持活力:pH值为3时,能耐100加热处理45min 
2
、溶菌酶化学性质非常稳定,当pH值在一定范围内剧烈变化时,其结构几乎不变。溶菌酶不可逆变性的临界点是77,随溶剂的变化,不可逆变性临界点也发生变化,当溶菌酶所处溶液pH值小于1时,不可逆变性临界点降低到43  
3
、溶菌酶最适pH5.3~6.4,可用于低酸性食品防腐; 溶菌酶作为防腐剂安全性高,可被冷冻或干燥处理,且活力稳定。 
4
、溶菌酶对几种变性剂的敏感程度为:二恶烷>二甲基乙酰胺>二甲基甲酰胺>丙酮,并且随溶剂用量的增加而直线下降。 

制备方法:
目前溶菌酶可以以鸡蛋清和蛋壳膜为材料提取制得,常用的方法有亲和层析法、离子交换树脂法、直接结晶法和聚丙烯酸沉淀法等。 
1
、亲和层析法
亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性,即蛋白质或酶与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的色谱技术。酶一底物复合物形成之后,在一定的条件下分离复合物便得到纯净的酶。常常使用的吸附剂为几丁质及其衍生物,如:几丁质粉、羧甲基几丁质、几丁质包埋纤维素、脱氨几丁质粉、N-酰化壳聚糖、脱氨再生几丁质凝胶。 

2
、离子交换树脂法
离子交换法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所生的交换反应来进行分离的,分离的效果较好,广泛用于微量组分的富集。一般流程为:鲜蛋一预处理一搅拌吸附一上柱洗脱一等电点沉淀一透析一喷雾干燥一成品。 
溶菌酶在等电点以下较广泛的pH值范围内,分子带正电荷,可吸附于弱酸性阳离子交换树脂上,洗脱后盐析,可得溶菌酶沉淀,再进行精制可得成品。蛋清吸附724树脂,洗涤缓冲液洗脱,硫酸铵溶液盐析透析,用NaOH去碱性蛋白,冻干溶菌酶,冻干粉沉淀干燥得到溶菌酶。在5—10下,将新鲜蛋清540kg加入到已处理好的80kg 724树脂中,搅拌吸附6h,在0—5静置过夜。倾出上层蛋清,树脂离心甩干,用蒸馏水反复洗去黏附的卵蛋白,然后将树脂装入柱内,用0.15mol/LpH=6.5磷酸缓冲溶液约150L洗涤树脂,再用约600L10%硫酸铵溶液洗脱,收集洗脱液。洗脱液中加硫酸铵,使最终含硫酸铵量为40%,有白色沉淀生成,冷处放置过夜。虹吸上层清液,沉淀吸滤抽干,再用1倍蒸馏水溶解沉淀呈稀糊状,然后装入透析袋,在约5的条件下,对蒸馏水透析24h左右,中间换水2—3次。离心去除沉淀,沉淀再用少量水洗一次,洗液与离心液合并。再往透析清液中慢慢加入1mol/L氢氧化na溶液,同时不断搅拌,使pH值上升到8.0—9.0,如有白色沉淀,即离心除去。然后用3mol/L盐酸调pH=5.0,冷冻干燥,即得白色片状溶菌酶。也可将离心液用3mol/L盐酸调pH=3.5,在搅拌下缓慢加入5%的固体氯化钠,在约5的温度下静置48h,离心,沉淀用0丙酮洗涤,干燥,即得溶菌酶。 

3
、食盐直接结晶法
在蛋清中加入一定量的碘化物或碳酸盐等盐类,并调pH值至9.5—10.0,溶菌酶会以结晶形式慢慢析出,而大多数蛋白质仍然在溶液。在超滤浓缩脱盐后,为获得较纯产品,采用结晶纯化酶液经超滤处理后,用NaOH调整pH 9.5,离心去除。上清液在缓缓搅拌下,加NaCl5%,静置一周,得粗结晶。结晶溶于pH 4.6醋酸水中,分去不溶物后,进行重结晶,结晶的最终得率为60%左右。即每公斤蛋清中可得重结晶品近1.3 g,活力测定为8000U/mg 

4
、聚丙烯酸沉淀法
聚丙烯酸沉淀法为将提取过滤后含酶洗脱液,首先经过吸附步骤,即将过滤后的澄清溶液用20%NaOH溶液调pH6.0,在调pH值的过程中不停的搅拌。有少量的乳白色沉淀析出,然后加入15%聚丙烯酸,立即有白色沉淀析出,加至pH值为3.0为止,静置17个小时进行静析,得到粘附于底部的乳白色胶状物。第二步解离,将前步得到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物。加入少量蒸馏水并用0.5 mol/L的碳酸钠,将其溶解,转移后,将pH值调到9.5。加入5%CaCl2溶液将溶菌酶聚丙烯酸解离,至无沉淀析出,然后过滤,得到澄清溶液。第三步盐析,将所得澄清溶液加入5%NaCI溶液搅拌均匀。放入冰箱调温度为0。待有晶体析出后,用无水乙醇洗涤数次,置恒温培养箱中40条件下干燥称重。


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