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Western blotting实验步骤
点击次数:2654 发布时间:2014-10-31

Western blotting实验步骤

1.蛋白质的样品制备:

取心肌组织50mg,待组织块自行溶解,用滤纸吸去其表面水分,将组织块放入玻璃匀浆器球状部位,用组织剪尽量将其剪碎,将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部,按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF(先加RIPA再加PMSF),将玻璃匀浆器插入冰中,匀浆约30分钟。

将心肌组织匀浆转移到离心管中,4℃12000g离心5分钟,收集上清(如有粘稠物进一步用超声处理),样品分装冻存于-20℃备用。

2 .测定蛋白浓度:

2.1 按50:1配置BCA工作液。

2.2 10ulC液(蛋白标准)+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。

2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中,在其他样品孔中加入10ul待测样品。

2.4 分别加PBS定容至20ul。

2.5 各孔中加入200ulBCA工作液,室温放置2小时。

2.6 用酶标仪测定蛋白浓度:测定A562,依标准曲线算出蛋白浓度。

3  SDS-PAGE电泳:

3.1 制 胶: 按比例配制分离胶,缓缓地摇动溶液,使激活剂混合均匀,将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中,再在液面上小心注入一层水,以阻止氧气进入凝胶溶液中,静置40min。同前按比例配制浓缩胶,但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分,连续平稳的注入凝胶溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡,静制60min以上以保证完全聚合。

3.2 预电泳: 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中,小心拔去梳子,加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。(目的是清除凝胶内的杂质, 疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通)。

3.3 样品准备:首先计算上样体积,然后按样品:上样buffer=4:1的比例加入上样bufer混匀,沸水煮10分钟,冰上5分钟。

3.4 加 样: 预电泳后依次加入标准品(Marker)和待分析样品。(加样时间要尽量短,以免样品扩散,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。

3.5 电 泳: 加样完毕,选择80V恒压进行电泳,电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处(一般约20分钟),更换至100V恒压电泳,电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处,即停止电泳(一般约为1小时20分钟)。

4.转 膜:

4.1 切胶:将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中,将目的蛋白所在区域切下来,测量其长宽,并记录。

4.2 剪膜和滤纸:按胶的尺寸剪膜和滤纸(滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm,PVDF膜长宽较凝胶大0.5~1mm),滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟,膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟,然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟,进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。

4.3 向电转槽中倒入部分电转液,将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”(注意避免两边滤纸相互接触,以免发生短路)。从正极到负极按如下顺序排列:正极-海绵-双层滤纸-PVDF膜-凝胶-双层滤纸-海绵-负极。(其中不能留有气泡)卡紧转膜板,电转槽中倒满电转液,将转膜板浸入电转槽中,注意正负极要正确。插上电源,设定恒流20mA转膜,4℃冰箱中。

5、膜的封闭: 用TBST液洗涤印迹膜10分钟x2次。放入5%脱脂奶粉封闭液内,摇床震动,70转/分钟,室温封闭1小时30分钟。

6、一抗孵育:

6.1 配制一抗:按相应抗体的效价加入一抗稀释液,一抗稀释液按0.05% TBST(ml):脱脂奶粉(g)=20:1配制。

6.2一抗孵育:将封闭后的膜放入杂交袋中,加入一抗约1ml,室温摇床(70转/分钟)孵育1小时30分钟。

6.3 用TBST洗涤膜10分钟x3次。

7、二抗孵育:

7.1 配制二抗:按相应抗体的效价加入二抗稀释液,二抗稀释液按0.05%TBST(ml):脱脂奶粉(g)=20:1配制。

7.2 二抗孵育:将一抗孵育后的膜放入二抗中,室温摇床(70转/分钟)孵育1小时30分钟。

7.3 用TBST洗涤膜10分钟x3次。

8、ECL显色

8.1 配制ECL工作液:在避光的容器中按A液:B液=1:1的比例配制。

8.2 按膜:工作液=10cm2:1ml的比例将ECL工作液覆盖到膜表面,放置1~2分钟后在凝胶成像系统中观察、拍照。

我们的实验过程如下:

 电泳: SDS-PAGE; 预电泳 恒压55 V 20 min,上样25 ul, 恒压55 V 40 min左右,当样品至分离胶面时,恒压75 V,到考马斯亮蓝至底部,停止电泳。

转印:制作转印三明治,150 mA。8%-90 min,10%-80min,12%-50min。中止转印,有条件可以利用丽春红检测总蛋白转印是否成功。

封闭:将转印膜取出,用去离子水清洗,TBST洗一次5 Min后,加入5%的脱脂牛奶封闭,于28度封闭2小时。(注意封闭液,一抗稀释液,二抗稀释液均含有脱脂牛奶,可以配成含0.01%硫柳汞的溶液以免牛奶变质)

 洗膜1次,10 min,

 一抗孵育:一抗浓度1:100(2.5%牛奶抗体稀释液),4度孵育隔天

 洗膜4次,每次15 min

 二抗孵育:二抗浓度1:3000(2.5%牛奶抗体稀释液),28度孵育1.5-2 H

 洗膜4次,每次15 min(建议洗膜完毕后,不要立刻显色,静置或者轻摇1.5h-2h后再显色)

显色:注意显色时间的控制和曝光时间的控制

祝您工作顺利,实验顺利!

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