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细胞迁移以及侵袭实验
点击次数:1915 发布时间:2015-07-31

  迁移实验(cell migration assay)

 实验材料
(1)ThinCert插入式细胞培养器: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Greiner662638)

(2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10%血清培养基,PBS,0.02%EDTA

(3)固定液:甲醇

(4)染色液:Giemsa染液

(5)封片剂:中性树胶

(6)其他:小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片

 操作步骤

(1)所有细胞培养试剂和ThinCert放在37℃温育;

(2)待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤一次,

 用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度  为2×105 /ml;

(3)在下室(即24孔板底部)加入600-800μl 含10%血清的培养基,上 室加入100-

 150μl细胞悬液,继续在孵箱培养24小时;

(4)用镊子小心取出ThinCert,吸干上室液体,移到预先加入约800μl甲醇的孔中,室温固定30分钟;

(5)取出ThinCert,吸干上室固定液,移到预先加入约800μl Giemsa染液 的孔中,室温染色15-30分钟;

(6)轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出ThinCert,吸去上室液体,用湿棉棒小 心擦去上室底部膜表面上的细胞;

(7)用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片;

 (8)显微镜下取9个随机视野计数,统计结果。

  注意事项

(1)根据待测细胞体积大小选择合适孔径的ThinCert。常用的为8.0-μm孔径(如

  AGS细胞),如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径;

(2)根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规24-well  ThinCert接种细胞数约

 为2≈5×104/well, 迁移时 间 12≈36小时;

(3)由于Greiner公司的24-Transwell内含24个独立的ThinCert,为了避免操作污染,

 每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板(Greiner);

(4)如果细胞迁移能力较弱,下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得 的上清加50μg/ml FN(Fibronectin),

 具体可查  阅相关文献;

(5)细胞悬液加入膜中央,尽量保证液面水平;

(6)固定染色擦洗时动作小心,避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜 表面上未迁移的细胞,

 以免影响读数。尤其是  膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗,但要小心避免将膜戳破;

(7)Chamber和膜上都无法标记,操作时应小心避免混淆实验组和对照组;

(8)充分晾干,避免残留水分导致镜下聚焦不一致。



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