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迁移实验(cell migration assay)
实验材料
(1)ThinCert插入式细胞培养器: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Greiner662638)
(2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10%血清培养基,PBS,0.02%EDTA
(3)固定液:甲醇
(4)染色液:Giemsa染液
(5)封片剂:中性树胶
(6)其他:小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片
操作步骤
(1)所有细胞培养试剂和ThinCert放在37℃温育;
(2)待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤一次,
用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度 为2×105 /ml;
(3)在下室(即24孔板底部)加入600-800μl 含10%血清的培养基,上 室加入100-
150μl细胞悬液,继续在孵箱培养24小时;
(4)用镊子小心取出ThinCert,吸干上室液体,移到预先加入约800μl甲醇的孔中,室温固定30分钟;
(5)取出ThinCert,吸干上室固定液,移到预先加入约800μl Giemsa染液 的孔中,室温染色15-30分钟;
(6)轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出ThinCert,吸去上室液体,用湿棉棒小 心擦去上室底部膜表面上的细胞;
(7)用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片;
(8)显微镜下取9个随机视野计数,统计结果。
注意事项
(1)根据待测细胞体积大小选择合适孔径的ThinCert。常用的为8.0-μm孔径(如
AGS细胞),如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径;
(2)根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规24-well ThinCert接种细胞数约
为2≈5×104/well, 迁移时 间 12≈36小时;
(3)由于Greiner公司的24-Transwell内含24个独立的ThinCert,为了避免操作污染,
每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板(Greiner);
(4)如果细胞迁移能力较弱,下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得 的上清加50μg/ml FN(Fibronectin),
具体可查 阅相关文献;
(5)细胞悬液加入膜中央,尽量保证液面水平;
(6)固定染色擦洗时动作小心,避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜 表面上未迁移的细胞,
以免影响读数。尤其是 膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗,但要小心避免将膜戳破;
(7)Chamber和膜上都无法标记,操作时应小心避免混淆实验组和对照组;
(8)充分晾干,避免残留水分导致镜下聚焦不一致。